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生物质谱/MALDI-TOF百科

生物质谱/MALDI-TOF
生物质谱/MALDI-TOF 生物质谱仪,其离子化方式主要是电喷雾电离与基质辅助激光解吸电离,前者常采用四极杆质量分析器,所构成的仪器称为电喷雾(四极杆)质谱仪(ESI-MS),后者常用飞行时间作为质量分析器,所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 (MALDI-TOF-MS)。ESI...   详细内容>>

生物质谱/MALDI-TOF


生物质谱仪,其离子化方式主要是电喷雾电离与基质辅助激光解吸电离,前者常采用四极杆质量分析器,所构成的仪器称为电喷雾(四极杆)质谱仪(ESI-MS),后者常用飞行时间作为质量分析器,所构成的仪器称为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪 (MALDI-TOF-MS)。ESI-MS的特点之一是可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用,从而大大扩展了其在生命科学领域的应用范围,包括药物代谢、临床和法医学的应用等;MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高,且测样速度快,操作简单。此外,可用于生物大分子测定的质谱仪还有离子阱(ion trap,IT)质谱和傅里叶变换离子回旋共振(Fourier transform ion cyclotron resonance,FTICR)质谱等。

较新型的生物质谱仪是液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱仪(LC-ESI-MS-MS)与带有串联质谱功能的MALDI-TOF质谱仪,前者是在传统的电喷雾质谱仪的基础上采用飞行时间质量分析器代替四极杆质量分析器,大大提高了仪器的分辨率、灵敏度和质量范围;后者是在质谱中加入了源后降解(post-source decay,PSD)模式或碰撞诱导解离(collisionally induced dissociation,CID)模式,从而使生物大分子的测序成为可能。

MALDI-TOF仪器组成及原理


MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱, 英文名Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱,其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。

仪器主要由两部分组成:基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)和飞行时间质量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量传递给生物分子,而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子,而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术,适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(M/Z)与离子的飞行时间成正比 ,检测离子。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点,为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段,并正扮演着越来越重要的作用。

MALDI-TOF作用及特点


分子量是有机化合物最基本的理化性质参数。分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。MALDI-TOF是一种软电离技术,不产生或产生较少的碎片离子。它可直接应用于混合物的分析,也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。分子量也是生物大分子如多肽、蛋白质等鉴定中首要的参数,也是基因工程产品报批的重要数据之一。MALDI-TOF的准确度高达0.1%-0.01%,远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。

蛋白质组学是当前生命科学研究的前沿领域。对蛋白质快速、准确的鉴定是蛋白质组学研究中必不可少的关键性的一步。采用MALDI-TOF-MS测得肽质量指纹谱(PMF)在数据库中查询识别的方式鉴定蛋白质,是目前蛋白质组学研究中最普遍应用的最主要的鉴定方法。肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列(一级结构)都不同,当蛋白被水解后,产生的肽片段序列也各不相同,因此其肽质量指纹图也具有特征性。MALDI-TOF-MS分析肽混合物时,能耐受适量的缓冲剂、盐,而且各个肽片几乎都只产生单电荷离子,因此MALDI-TOF成为进行分析PMF的首选方法。

由于PMF鉴定结果的可靠性受诸多因素影响,使得部分鉴定结果往往不是十分明确,特异性不高。多肽氨基酸序列匹配被认为是特异性最好的鉴定方法。在蛋白质组学研究中,利用质谱测序一般采用两种方式:一种是利用串联质谱(MS/MS)测序;另一种是利用源后衰变(post-source decay,PSD)技术测序。

在反射式MALDI-TOF-MS中,当脉冲激光照射到微量样品与饱和小分子基质混合形成的共结晶上时,能量通过基质传递给样品,导致样品被解析电离,电离后形成的亚稳分子离子在飞经无场区(即飞行管区)时发生裂解(其活化能来自在离子源与基体发生的碰撞,在无场区与残留气体的碰撞,激光辐射及各种热机制等)所产生的子离子(即源后分解碎片离子),可以通过不断改变反射器电压来进行分离、收集并记录于检测器,形成能为多肽和蛋白质一级结构提供十分丰富而有效的结构信息的PSD质谱图。利用PSD谱图,结合数据库检索可以迅速、高特异性地鉴定蛋白质。

目前,在蛋白质组学研究中,部分经2DE分离的蛋白质样品无法通过PMF鉴定或鉴定结果不明确,可将PSD测序功能应用于这些蛋白质的鉴定。随着对PSD技术的不断研究和发展,尤其是结合MALDI-TOF-MS本身所具有的高灵敏度、高通量、样品靶点可多次应用测定、分析时主要产生单电荷准分子离子以及能够耐受一定量的盐和干扰物等特点,PSD-MALDI-TOF-MS将会在蛋白质组学、代谢组学以及药物筛选的研究中发挥更大的作用。

此外,随着分子生物学技术和反义核酸药物技术的发展,越来越多的寡核苷酸片段被合成,用以作引物、探针以及反义药物等。对这些片段进行快速检测,以判断合成的是否完全及合成的序列是否正确,是完全必要的。包括MALDI-TOF-MS在内的生物质谱是迄今为止进行这种检测最好的手段。用MALDI-TOF-MS测定分析寡核苷酸,简单、快速、准确、灵敏。结合3’外切酶和5’外切酶可以对寡核苷酸全序列进行测定。
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